UJI HASIL ISOLASI DNA

UJI HASIL ISOLASI DNA

A.  Pendahuluan

1.      Latar belakang

Perkembangan ilmu biologi molekuler di dunia begitu pesat,hal ini dipengaruhi oleh perubahan pola fikir dan keadaan wilayah sehingga banyaknya ilmu-ilmu yang mempelajari bagaimana memaksimalkan DNA dan mempelajari perubahan DNA (genetik) karena perubahan lingkungan maupun karena hal lainnya. DNA merupakan pembawa informasi genetik yang akan diturunkan kepada generasi penerusnya. Memodifikasi informasi ini akan menghasilkan generasi baru yang bisa bersaing dan mendapatkan keuntungan berlimpah,baik dari segi budaya maupun ekonomi serta sosial.

Isolasi DNA merupakan proses untuk mendapatkan DNA murni yang bebas dari RNA maupun protein lainnya hal ini didasarkan pada proses sentrifugasi (berat molekul),kemudian dilanjutkan dengan amplifikasi DNA dengan PCR. Hal tersebut bermanfaat dalam memperbanyak jumlah DNA agar bisa dimanfaatkan lebih maksimal karena jumlahnya lebih banyak. Kemudian diidentifikasi dengan proses RFLP agar tahu variasi-variasi dari bahan genetic tersebut. Hasilnya dilihat menggunakan Elektroforesis Gel Poliakrilamid untuk mengetahui visualisasi dari semua praktikum diatas. Agar bisa ditentukan berat molekul dan menentukan keberhasilan teknik tersebut.

 Ilmu dasar yang harus dimiliki untuk bisa mengolah data genetik yaitu harus mengetahui dan memahami teknik Isolasi DNA, spektrofotometer dan Elektroforesis Gel. Hal tersebut juga berkaitan dengan dalam purifikasi DNA dan hasilnya. Oleh karena itu perlunya mengetahui cara isolasi DNA dengan menggunakan spektrofotometer dan elektroforesis untuk mengetahui dari segi kuantitas dan kualitas DNA yang dipraktekkan layak atau tidak.

2.      Tujuan praktikum

Praktikum uji hasil isolasi DNA bertujuan untuk :

a.       Mengetahui teknik uji isolasi hasil DNA

b.      Mengetahui procedure uji hasil

c.       Mengetahui karakteristik DNA yang baik melalui uji hasil

3.      Waktu dan tempat praktikum

Praktikum isolasi DNA tanaman dilaksanakan pada hari selasa 18 Maret 2014 pukul 08.00-10.00 WIB di laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta.

B.  Tinjuan Pustaka

Uji kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA. Hal ini bertujuan untuk mengeluarkan DNA yang berada dalam inti sel dari organisme. Kemudian dilakukan dengan uji kualitatif DNA dengan metode elektroforesis gel agarosa. Uji ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan DNA dalam larutan contoh. Setelah itu dilanjutkan dengan uji kuantitatif DNA dengan metode spekrofotometri. Spektrofotometri merupakan suatu  metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi         (Fatchiyah 2011).

Uji kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu, spektrofotometri Vis (Visible) dan Spektrofotometri UV- Vis (Ultraviolet Visible). Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang  cahaya tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua  cahaya yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, atau warna apapun selama ia dapat dilihat oleh mata, maka cahaya tersebut termasuk ke dalam cahaya tampak (visible). Spektrofotometri UV-vis merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuatberwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. (Aris  2010).

Prinsip kerja elektroforesis adalah memisahkan molekul-molekul bermuatan listrik berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan muatan listriknya. Khusus untuk DNA, pemisahan tidak didasarkan atas perbedaan muatan listriknya, tetapi menurut ukuran dan konformasi atau struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan adalah agarosa dan poliakrilamid. Gel agarosa digunakan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb), sedangkan gel poliakrilamid digunakan untuk fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil (Anonim 2010).

Macam elektroforesis berdasarkan media yaitu elektroforesis kertas dengan menggunakan media kertas saring whatman dan kanji. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks. Elektroforesis gel yang terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan protein-protein serum manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh (Yuwono 2006).

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan medium pendukung untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan medium pendukung yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Efek penguapan juga dapat diturunkan minimal jika elektroforesis dilakukan di medium pendukung yang dicelupkan dengan larutan buffer. Pemisahan sempurna suatu campuran dapat terjadi efektif dalam zona tertentu. Meskipun medium pendukung relatif stabil (inert), komposisinya mungkin akan menyebabkan penyerapan, migrasi elektron (elektro osmosis) atau penyaringan berdasarkan ukuran molekulnya, yang kesemuanya mempengaruhi kecepatan gerak senyawa. Larutan buffer (penyangga) ini menstabilkan pH medium pendukung. Buffer juga dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa (Harsono 2006).

C.  Alat, Bahan, dan Cara Kerja

1.      Alat

a.       Spektrofotometer

b.      Kuvet

c.       Hot plate

d.      Cetakan agarose

e.       Sisir elektroforesis

f.       Mikropipet

g.      Tip

h.      Ependorft  

2.      Bahan

a.       Etidium bromide/floresafe

b.      DNA

c.       Agarose

d.      Loading dye/ bromtimol blue

3.      Cara kerja

a.       Uji spektrofotometer

1)      Menyiapkan spektrofotometri UV-Vis, alkohol, aquadest, tip blue dan yellow, dan DNA yang telah diisolasi

2)      Menghidupkan spektrotometri serta mengatur program

3)      Mengisi kuvet dengan 1998 µl aquadest kemudian tekan tombol kalibrasi untuk membuktikan bahwa pengenceran benar-benar air

4)      Memasukkan 2 µl DNA dari hasil isolasi menggunakan tip yellow

5)      Menekan tombol pengukuran

6)      Mencatat hasil yang nampak pada alat spektrofotometri

b.      Uji elektroforesis

1)      Pembuatan gel (biorad) dengan menuangkan 30 ml TBE ke dalam Erlenmeyer

2)      Menimbang agarose sesuai dengan konsentrasi yang akan digunakan, misalnya untuk konsentrasi 1,5% maka dibutuhkan agarose:1,5/100 x 30 ml = 0,45 g

3)      Menuangkan agarose ke dalam Erlenmeyer dan menutup alumunium foil kemudian dilubangi

4)      Memanaskan Erlenmeyer berisi agarose dengan microwave selama 1 menit, mengeluarkan dan menggojog perlahan

5)      Mengulangi sebanyak 3-4 x hingga agarose benar-benar larut dan homogen

6)      Pemanasan terakhir larutan digojog perlahan dengan hati-hati agar tidak terjadi gelembung udara pada larutan

7)      Mendiamkan hingga gel mengeras

8)      Menuangkan buffer TBE 1 x ke dalam tangki elektroforesis hingga setengahnya

9)      Meletakkan gel ke dalam tengki dengan posisi sumuran pada kutub negative tengki

10)  Menambahkan buffer TBE 1 x hingga gel tenggelam dalam buffer

11)  Mengambil loading dye untuk 5 µl DNA dan dicampur

12)  Memasukkan gel tepat pada lubang sumuran sample untuk menghindari kontaminasi sample yang lain

13)  Menutup tengki dan mengatur alat sesuai voltase dan waktu yang digunakan

14)  Kemudian dilakukan visualisasi

D.  Hasil dan Pembahasan

1.      Hasil Pengamatan  

a.       Uji spektrofotometri

 

Gambar 2. Bagan Uji Spektrofotometri UV-Vis

Analisis data :

260 λ = 0,014 AB

280 λ = 0,061 AB

1.      Konsentrasi           = 0,014/2.10^-5

= 700 ng/µl

2.      Kemurnian            = 260 λ/280 λ

= 0,014/0,061

= 0,229

b.      Elektroforesis

1)      Pembuatan media agarose

 

Gambar 3. Bagan Pembuatan Media Agarose

2)      Elektroforesis

 

Gambar 4. Bagan Cara Elektroforesis

3)      Gel doc

 

Gambar 5. Cara Visualisasi DNA

Gambar 6. Hasil Visualisasi DNA Daun Salak

2.      Pembahasan

Isolasi DNA adalah teknik esensial dalam biologi molekuler. Isolasi DNA adalah tahap awal dalam mempelajari DNA sequence yang spesifik dengan populasi DNA yang lengkap, dan dalam analisa struktur gen dan ekspresi gen. tujuan isolasi DNA adlah mengenal dan mempraktekkan teknik dalam melakukan isolasi DNA dari tanaman dan DNA jaringan / sel hewan. Metode yang digunakan meliputi lisis sel, pemisahan protein dan kontaminan lainnya,, presipitasi DNA dan penentuan konsentrasi DNA, pemurnian dan pemanenan DNA (Subandiyah 2006).

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus.

Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol.

Tujuan utama untuk mengetahui hasil dari isolasi DNA adalah melihat keberhasilannya dapat dilihat dari segi kuantitas dan kualitas DNA. Berdasarkan hasil praktikum isolasi DNA daun salak dengan metode 3 yaitu doyle and doyle dari konsentrasi 700 ng/µl dengan kemurnian sebesar 0,229. Hal ini menunjukkan bahwa kualitas DNA masih rendah yang disebabkan oleh terkontaminasi dengan protein yang lain.

E.  Kesimpulan dan Saran

1.      Kesimpulan

Berdasarkan praktikum hasil isolasi DNA dapat disimpulkan bahwa :

a.       Uji hasil isolasi DNA dilakukan untuk mengetahui kemurnian DNA atau  kualitas dan kuantitas.

b.      Prosudure dasar isolasi DNA adalah lisis sel, pemisahan protein dan kontaminan lainnya,, presipitasi DNA dan penentuan konsentrasi DNA, pemurnian dan pemanenan DNA.

c.       Kemurnian hasil isolasi DNA jika nilai DNA berkisar antara 1,6 and 2,00. jika nilainya kurang dari 1,6 maka DNA terkontaminasi oleh protein lain, sedangkan jika nilai DNA lebih dari 2,00 maka DNA tersebut telah terkontaminasi oleh oleh chlorofoarm atau phenol.

2.      Saran

Sebaiknya dalam pelaksanaan praktikum tidak hanya satu jenis tanaman yang diekstraksi secara langsung, tapi ada bagian tanaman sehingga dapat dibandingkan secara langsung kualitas dan kuantitas DNA yang dihasilkan.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim 2010. Perpustakaan Gen. http://biomol.edublogs.org. Diakses pada tanggal 5 April 2014.

Aris. 2010. Isolasi DNA. http://asris07.student.ipb.ac.id. Diakses tanggal 5 April 2014

Fatchiyah, 2011. Modul Pelatihan Analisis Fingerprinting DNA Tanaman. Dengan Metode RAPD. Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Brawijaya. Malang.

Harsono  2006. Bioteknologi. Jakarta: Yudhistira.

Subandiyah, S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi Patogen Tumbuhan. Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Pelatihan dan Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR. Malang. hlm. 43-50

Yuwono T 2006. Bioteknolgi Pertanian. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.