ISOLASI DNA TANAMAN
ISOLASI DNA TANAMAN
A. Pendahuluan
1. Latar
belakang
DNA merupakan suatu materi genetik yang
terbentuk dari dua kelompok basa yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu
purin dan pirimdin. Dua purin yang paling banyak terdapat dalam DNA adalah
adenin dan guanin, dan pirimidin yang umum adalah sitosin dan timin. Purin dan
pirimidin berisi beberapa ikatan ganda yang berhubungan. DNA tersusun atas 3
komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang
tergabung membentuk nukleotida.
Pengenalan isolasi DNA sangatlah
penting, mengingat bioteknologi pada akhir-akhir ini sangat maju, terlebih
untuk bidang pertanian. Beberapa bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam
tanaman padi, kapas, dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan
keanekaragaman hayati dimasa mendatang memerlukan sebuah keterampilan dan
pemikiran. Melalui isolasi DNA tersebut paling tidak akan menjadi pembelajaran
bagi mahasiswa mengenai cara pengumpulan DNA.
Pengumpulan DNA dalam prakteknya
terdapat beberapa metode yang dapat digunakan. Metode –metode yang digunakan
dalam isolasi DNA tentunya memiliki perbedaan yang mendasar khususnya kualitas
yang DNA dihasilkan. Oleh karena itu dengan mempelajari metode-metode yang
digunakan dalam praktek bioteknologi diharapkan dapat mengetahui hasil kualitas
dan kuantitas DNA yang didapatkan.
2. Tujuan
praktikum
Praktikum isolasi DNA tanaman bertujuan
untuk :
a. Membandingkan
3 metode isolasi yang berbeda
b. Mengetahui
proses isolasi DNA
c. Memahami
fungsi tiap-tiap perlakuan
d. Mendapatkan
DNA yang baik dan sesuai standar
3. Waktu
dan tempat praktikum
Praktikum isolasi DNA tanaman
dilaksanakan pada hari selasa 11 Maret 2014 pukul 08.00-10.00 WIB di
laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas
Sebelas Maret Surakarta.
B. Tinjauan pustaka
Ekstraksi atau isolasi asam nukleat
adalah salah satu teknik dasar yang harus dikuasai dalam mempelajari teknik
biologi molekular. Tujuan dari ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah
membuang dan memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya (protein,
karbohidrat dan lemak). Pemisahan tersebut dilakukan sehingga asam nukleat yang
diperoleh dapat dianalisis dan atau dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik
biologi molekular lainnya (Corkill dan
Rapey 2008).
Pada prinsipnya isolasi DNA sel
harus dipecah terlebih dahulu dengan beberapa agensia, baik secara fisik kimia
atau dengan mempergunakan enzim tertentu. Pemecahan dengan cara fisik misalnya
dengan menggunakan alat sonikator, yaitu merupakan alatb yang menghasilkan
suara ultra tinggi. Pemecahan dengan alat ini biasanya cukup fektif untuk
memecah sel bacteri, tetapi kurang efektif untuk memecah sek eukaryote. Pemecahan
sel juga dapat dilakukan dengan menggunakan enzim lisozim yang dapat memecah
dinding sel. Seringkali penggunaan enzim ini dikombinasikan dengan perlakuan
fisik, misalnya dengan pemansan sehingga sel lebih mudah pecah. Senyawa lain
yang sering digunakan untuk memecah sel untuk isolasi DNA adalah CTAB (Cetyl
Trimetyl Ammonium Bromide)( Yuwono 2006).
Sebuah isolasi yang baik harus
sederhana, cepat dan efisien serta menghasilkan jumlah DNA yang cukup
berkualitas tinggi yang cocok untuk analisis molekuler. Hasil DNA dari protokol
yang dioptimalkan diamati secara luas bebas dari polyphenolik dan
metabolit sekunder, sebagaimana ditentukan oleh digesti yang sukses dengan
restriksi endonuklease dan amplifikasi PCR. Semua metode tersebut pada umumnya
menggunakan detergen seperti SDS untuk melisiskan dinding sel, dan sering
menghambat manipulasi pemurnian lebih lanjut (Alatar, et al, 2012).
Isolasi DNA adalah memisahkan
DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa
dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis
dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel
tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase
(yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA.
Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90oC untuk
menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di
presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air (Susanto 2012).
Terdapat berbagai macam metode isolasi
DNA tanaman. Metode-metode tersebut menggunakan CTAB dan SDS dalam ekstraksi
DNA. Beberapa metode isolasi DNA juga menggunakan nitrogen cair pada tahap awal
ekstraksi untuk menghasilkan kualitas DNA terbaik. Protokol Doyle & Doyle
(1999) sering digunakan untukekstraksi DNA tanaman. Selain itu, terdapat
protokol laindalam ekstraksi DNA, yaitu Dellaporta et al. (1983), Jobes et al.
(1995), Zheng et al. (1995) serta masih banyak metode lainnya. Namun, tidak
semua protokol tersebut cocok untuk semua jenis tanaman(Utami et al. 2012).
CTAB merupakan sejenis deterjen yang
dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat merusak
membran sel dan melarutkan DNA Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi
sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.
penambahan buffer TE. Buffer TE berfungsi untuk melarutkan DNA yang dihasilkan
dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung EDTA yang
berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor
yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease (Yuwono 2006).
Isolasi DNA atau ekstraksi DNA
tanaman secara umum melalui 3 tahap yaitu pemecahan sel, keluarnya DNA dari
nukleus, dan presipitasi DNA. Metode mengisolasi DNA dari tanaman berbagai
macam,namun 3 faktor utama yang harus dipenuhi yaitu cara dalam menghomogenkan
jaringan tanamn khusus dinding sel. Komposisis lar buffer yang ditambahkan dan
penghilangan debrish (kontaminan) (Hendro 2010).
C. Alat, Bahan, dan Cara Kerja
1. Alat
a. Erlenmeyer
b.
c. Gunting
d. Gelas
ukur
e. Pipet
dan rubber
f. Mikropipet
g. Oven
h. Autoklaf
i.
Hot plate
j.
Votex
k. Water
bath
l.
centrifuge
m. Timbangan
analitik
n. Mortar
dan pestle
o. Thermocycler
p. Uv
transiluminator
q. Spektrofotometer
r.
Elektroforesis
2. Bahan
a. Tris-EDTA
b. CTAB
c. Mercaptoetanol
d. CIAA
e. Isopropanol
f. Aquadest
g. Sodium
acetat
h. Loading
dye
i.
Floresafe/etidium bromide
j.
TAE/TBE
k. Etanol
l.
Chloroform
m. Daun
n. salak
3. Cara
kerja
Metode
3 (Doyle and Doyle 1990)
a. DNA
genomic sample dengan menggunakan 0,15 gram daun, yang kemudian digerus hingga
lembut dengan bantuan nitrogen cair
b. Tabung
ditambahkan 750 µl buffer ekstraksi CTAB yabg ditambah Mercaptoetanol 75 µl
c. Campuran
tersebut divortex lalu diinkubasi dalam pemanas air selama 60 menit pada suhu
65oC
d. Setelah
dibiarkan dingin hingga suhu kamar, campuran tersebut ditambahkan dengan 750µl
kloroform-isoamil alkohol (24:1)
e. Campuran
disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 4oC
f. Lapisan
atas dimasukkan ke dalam tabung ependorft lain yang mengandung isopropanol
150µl dan dicampur merata kemudian disentrifugasi
g. Setelah
disentrifugasi selama 10 menit 11.000 rpm, endapan DNA dicuci dengan
menambahkan etanol 70 % 500 µl dan dikeringkan
h. Endapan
DNA yang telah kering dilarutkan dalam 25 µl buffer TE (10mM Tris-HCl pH 8,0 ;
1 mM EDTA pH 8,0)
i.
DNA disimpan pada suhu -20oC
D. Hasil dan Pembahasan
1. Hasil
Pengamatan
 |
|||||||||||||||||||||
 |
|||||||||||||||||||||
 |
|||||||||||||||||||||
 |
|||||||||||||||||||||
 |
|||||||||||||||||||||
 |
|||||||||||||||||||||
 |
|||||||||||||||||||||
 |
|||||||||||||||||||||
 |
|||||||||||||||||||||
 |
|||||||||||||||||||||
 |
|||||||||||||||||||||
 |
|||||||||||||||||||||
 |
|||||||||||||||||||||
Gambar 1. Bagan isolasi DNA daun
salak (Zalaca sp.) metode 3 (Doyle and Doyle 1990)
2. Pembahasan
Asam Deoksiribonukleat, yang lebih
dikenaldangan DNA, adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama
penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak
didalam inti sel. DNA berperan di dalam sebuah sel ialah sebagai materi genetic
artinya, DNA menyimpan cetakan baru bagi segala aktivitas sek. Dan pengecualian
bagi beberapa jenis virus seperti HIV (Human
Papilioma Virus). DNA merupakan polimer yang terdiri dari tiga komponen
utama, yaitu gugus fosdat, gula deoksiribonukleat, dan basa nitrogen. Sebuah
unit monomer DNA yangterdiri dari ketiga komponen tersebut dinamakan
nukleotida, sehinnga DNA tergolong sebagai polinukleotida. Isolasi DNA merupakan suatu proses untuk
mendapatkan DNA murni yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau
diagnosa. DNA dapat di isolasi dari berbagai sel yang memiliki inti sel, karena
DNA terletak di dalam inti sel.
Adapun isolasi DNA itu sendiri pada
dasarnya mengambil DNA murni dari sediaan yang tersedia kemudian membuang RNA
maupun protein-protein lainnya. Sehingga perbedaan berat molekul akan membuat
DNA akan naik ke atas dan yang lainnya di bawah (dalam proses sentrifugasi).
Pada saat penambahan buffer lisis itu dimaksudkan untuk melisiskan dinding
selnya agar materi di dalamnya bisa keluar. Selanjutnya vortex bertujuan untuk
mempercepat percampuran hal tersebut. Setelah tercampur secara maksimal,maka
kombinasi tersebut akan disentrifugasi agar yang berat molekulnya lebih tinggi
akan tersingkir ke bawah dan DNA (supernatant) akan naik ke atas,sehingga DNA
murni bisa didapatkan.
Isolasi DNA dapat dilakukan dengan
berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis maupun bagian tanaman dapat
menimbulkan masalah berbeda, antara lain faktor karena adanya senyawa polifenol
dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA serta
mempengaruhi enzim-enzim seperti polimerase, ligase, endonuklease restriksi,
atau enzim untuk kegiatan molekuler lain yang dapat menyebabkan DNA tidak dapat
digunakan untuk aplikasi penelitian
(Hays 2006).
Isolasi DNA yang baik yaitu pada tahapannya
dapat dilihat dari hasil kualitas DNA murni yang didapatkan. Kemurnian hasil
isolasi DNA jika nilai DNA berkisar antara 1,6 and 2,00. jika nilainya kurang dari 1,6 maka DNA
terkontaminasi oleh protein lain, sedangkan jika nilai DNA lebih dari 2,00 maka
DNA tersebut telah terkontaminasi oleh oleh chlorofoarm atau phenol. Oleh
karena itu pada tahapan lisis sample DNA kurang baik sehingga DNA masih
terbungkus oleh protein lain, selain itu juga pada tahapan sentrifuge yang
kurang dapat menyebabkan DNA juga ikut terbuang. Pada proses pencucian dengan
klorofoam dan etanol juga dapat mempengaruhi hasil DNA.
Cara
isolasi DNA daun salak ditimbang sebanyak 0,5 - 0,7 g, lalu diletakkan dalam
cawan porselein steril dan ditambahkan 400 ul buffer ekstraksi CTAB kemudian
digerus dengan mortar steril sampai daun lumat. Daun sampel yang telah lumat
dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 2 ml, kemudian ditambahkan kembali buffer
ekstraksi CTAB sebanyak 400 μl dan divortex selama 2-3 menit. Tahapan selanjutnya dilakukan inkubasi sampel
dalam water bath bersuhu 65°C selama 15 menit sambil tabung dibolak-balik
setiap 5 menit. Tahapan ini dilakukan untuk mengoptimalkan kerja buffer ekstrak
yang ditambahkan ke dalam sampel. Sampel kemudian divortex selama 2-3 menit,
selanjutnya dilakukan sentrifugasi sampel dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10
menit dan diberi EDTA serta etanol. Tujuannya untuk memisahkan debris dan komponen
sel lain yang menjadi penyebab kontaminasi dengan DNA. Berdasarkan praktikum
yang dilakukan yaitu isolasi DNA daun salak di dengan menggunakan metode 3
yaitu doyle and doyle diperoleh pellet DNA atau edapan DNA yang sedikit. Hasil
dari isolasi tersebut disimpan pada suhu -20oC.
E. Kesimpulan dan Saran
1. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum isolasi DNA maka
dapat disimpulkan bahwa :
a. Isolasi
DNA dapat dilakukan dengan berbagai metode salah satunya metode doyle and doyle
yang telah banyak dimodifikasi
b. Tahap
isolasi DNA yaitu pelisisan atau perusakan untuk mendapatkan DNA total dan presipitasi atau endapan DNA dengan prose
setrifuge.
c. Hasil
DNA yang baik nilainya berkisar antara 1,6-2,0
2. Saran
Sebaiknya dalam pelaksanaan praktikum
tidak hanya satu jenis tanaman yang diekstraksi secara langsung, tapi ada bagian
tanaman sehingga dapat dibandingkan secara langsung kualitas dan kuantitas DNA
yang dihasilkan.
DAFTAR PUSTAKA
Alatar, AA, et al. 2012. Simple And Rapid Protocol For The
Isolation Of PCR-Amplifiable DNA From Medicinal Plants. Genetics and Molecular Research 11 (1):
348-354.
Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and Techniques. In:
Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R.
Humana Press, NJ, USA.
Hays, Lana. 2006. Introduction to DNA Extraction. http://www.tsl.orst.edu. Diakses pada
tanggal 5 April 2014.
Hendro 2010. Modul Praktikum Isolasi DNA dan Elektroforesis.
http://hendropram.edublogs.org.
diakses pada tanggal 5 april 2014.
Susanto, Agus Hery. 2012. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Fakultas Biologi Universitas Jenderal
Soedirman, Purwokerto.
Utami A, Meryalita R, Aeny N P, Ambarsari L, Asri P,
Kurniatin, Nurcholis W 2012. Variasi
Metode Isolasi DNA Daun Temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.). Prosiding
Seminar Nasional Kimia Unesa 2012 – ISBN : 978-979-028-550-7 .Biokimia FMIPA
IPB. Bogor.
Yuwono T 2006. Bioteknolgi Pertanian. Gadjag Mada
University Press. Yogyakarta
Komentar
Posting Komentar