AMPLIFIKASI DNA MENGGUNAKAN PCR

AMPLIFIKASI DNA MENGGUNAKAN PCR

A.      Pendahuluan

1.      Latar belakang

Perbanyakan DNA pada saat ini dapat dilakukan di luar sel (in vitro) dengan ditemukannya suatu alat yang disebut Polimerase Chain Reaction (PCR). PCR adalah metode yang dapat mengamplifikasi logaritma sekuen pendek DNA menjadi DNA heliks ganda yang panjang. Proses PCR meliputi 3 tahapan yaitu denaturasi, annealing, dan sintesis DNA. Komponen yang terlibat di proses PCR sama dengan proses replikasi, yaitu DNA polimerase, nukleotida, dan primer okazaki.

Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi DNA target sehingga jumlahnya menjadi banyak. Teknik tersebut dapat dilakukan secara in vitro dan berlangsung dalam waktu yang relatif cepat. Proses perbanyakan DNA dilakukan dengan menggunakan reaction mixture dan berlangsung dalam mesin thermal cycler. Reaction mixture merupakan campuran yang terdiri atas beberapa komponen, diantaranya berisi DNA cetakan yang akan diamplifikasi.

Teknik PCR merupakan suatu metode enzimatik untuk memperbanyak (amplifikasi) DNA secara in vitro (ekstraselular). Beberapa aplikasi metode PCR diantaranya human genome project, diagnosis penyakit genetic, analisis filogenetik dan lain-lain. Oleh karena itu, dilakukanlah praktikum teknik PCR sebagai modal awal sebelum mengaplikasikannya dalam bidang genetika yang lainnya.

2.      Tujuan Praktikum

Praktikum amplifikasi DNA menggunakan PCR bertujuan untuk mengetahui prinsip kerja dari PCR.

3.      Waktu dan Tempat Praktikum

Praktikum isolasi DNA tanaman dilaksanakan pada hari selasa 18 Maret 2014 pukul 08.00-10.00 WIB di laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta.

B.       Tinjauan Pustaka

PCR (Polymerase Chain Reaction) atau reaksi berantai polimerase adalah suatu metode enzimatis untuk memperbanyak secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu secara invitro. PCR pertama kali dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1985 seorang peneliti dari CETUS Corporation. PCR dapat melibat memperbanyak molekul DNA dan memisahkan gen-gen; kelebihan metode ini adalah suhu yang dapat tinggi dan rendah dengan cepat selain itu PCR juga bekerja dengan komponen yang jumlahnya sedikit (Yuwono 2006).

Tahap amplifikasi oleh PCR menyebabkan pita DNA mengalami denaturasi (DNA template memisah menjadi utas tunggal). Tahap ini membutuhkan suhu 94ºC. Tahapan selanjutnya adalah primer DNA menempel pada sekuen DNA target, dalam fase annealing ini suhu yang dipergunakan adalah 55-65ºC. Tahap ketiga yaitu elongasi (pemanjangan), primer DNA yang menempel pada sekuen tersebut memanjang sampai mencapai binding site dari pasangang primer lainnya. Suhu yang digunakan pada tahap ketiga tersebut yaitu 72ºC (Choirul 2006).

Prinsip kerja PCR yaitu menggunakan reaction mixture  serta memanfaatkan DNA polymerase  yang bersifat termostabil dan fragmen DNA yang pendek disebut primer. Primer berfungsi untuk mensintesis secara langsung sekuens DNA target spesifik dari DNA template. Reaksi sintesis tersebut terus berulang sehingga membentuk suatu siklus. Produk dari siklus sintesis sebelumnya dapat berfungsi sebagai template atau cetakan bagi siklus selanjutnya. Hasilnya ialah amplifikasi eksponensial dari sekuens DNA target. Siklus yang berulang tersebut dapat berlangsung karena penggunaan Taq polymerase. Taq polymerase ialah sebuah enzim polymerase bersifat termostabil yang diisolasi dari bakteri termofilik yaitu Thermus aquaticus (Astuti 2011).

Metode PCR dan elektroforesis hanya digunakan untuk mendeteksi ada atau tidaknya DNA HPV di dalam sel epitel yang dicurigai terinfeksi HPV. Hybrid Capture System (HC-II) adalah metode pemeriksaan hibridisasi dengan teknologi terbaru di bidang biologi molekuler. Metode Multiplex HPV Genotyping Kit adalah metode yang digunakan untuk mengetahui genotipe HPV (Novel 2009).

Pada metode terminasi rantai (metode Sanger), perpanjangan atau ekstensi rantai DNA dimulai pada situs spesifik pada DNA cetakan dengan menggunakan oligonukleotida pendek yang disebut primer yang komplementer terhadap DNA pada daerah situs tersebut. Primer tersebut diperpanjang menggunakan DNA polimerase, enzim yang mereplikasi DNA. Bersama dengan primer dan DNA polimerase, diikutsertakan pula empat jenis basa deoksinukleotida (satuan pembentuk DNA), juga nukleotida pemutus atau penghenti rantai (terminator rantai) dalam konsentrasi rendah (biasanya di-deoksinukleotida). Penggabungan nukleotida pemutus rantai tersebut secara terbatas kepada rantai DNA oleh polimerase DNA menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang berhenti bertumbuh hanya pada posisi pada DNA tempat nukleotida tertentu tersebut tergabungkan (Scheffler 2008).

C.      Alat, Bahan, dan Cara Kerja

1.      Alat

a.       Centrufugasi

b.      PCR

c.       Eppendorf

d.      Mikropipet

2.      Bahan

a.       Sample DNA 5µl

b.      Aquabides

c.       10 x Buffer PCR (500 Mm kcL, 100 mM Tris-HCl (pH8,4) pada suhu 20^oC, 15 mM MgCl12 dan 1 mg gelatin)

d.      10 x primer 1 5 µl

e.       10 x primer 2 5 µl

f.       Taqpolimerase 2,5 unit/50µl reaksi

3.      Cara kerja

a.       Mencampur semua komponen ke dalam eppendorf  hingga volume total 50 µl

b.      Menambahkan 50 µl lisat sel dan mencampur sampai homogen, kemudian menambahkan minyak paraffin ke atas campuran PCR

c.       Melakukan amplifikasi secara manual atau dengan menggunakan thermalcycler otomatos yaitu dengan menginkubasi pada suhu

1)      95oC selama 1 menit

2)      55oC selama 1 menit

3)      72oC selama 1 menit

d.      Mengulangi langkah ke poin ke c hingga  35 siklus

D.      Hasil dan Pemahasan

1.      Hasil Pengamatan

 

Gambar 7. Bagan cara isolasi DNA dengan PCR

 

Gambar 8. Hasil Amplifikasi DNA dengan PCR

2.      Pembahasan

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif. (Fatchiyah 2014).  Adapun tahap-tahap dari PCR yaitu :

1.    Denaturasi

Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94oC yang menyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan dibuat.

2.    Penempelan (Annealing)

Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer. Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target, diperlukan suhu yang rendah sekitar 55⁰C selama 30-60 detik. 

3.    Pemanjangan (Ektension)

Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polymerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA cetakan dan nukleotida.

Keunggulan metode PCR adalah kemampuannya dalam melipatgandakan suatu fragmen DNA sehingga dapat mencapai 109 kali lipat. Keberhasilan PCR ditentukan oleh beberapa hal. Konsentrasi dan kualitas DNA Konsentrasi DNA sebesar 0,01-0,1 µg setiap µl larutan template sudah cukup baik untuk PCR namun yang paling penting adalah DNA harus bebas dari pengotor seperti protein atau bahan-bahan yang tersisa saat purifikasi seperti fenol atau alkohol. Temperatur Annealing dari kedua primer Ukuran dan komposisi primer sangat mempengaruhi temperatur penempelan primer terhadap untaian DNA target. Konsentrasi MgCl2 Konsentrasi MgCl2 sangat mempengaruhi spesifikasi produk PCR, aktivitas serta kekhususan kerja enzim, penguatan primer mencapai suhu optimumnya (primer annealing) dan penguatan fungsi primer dalam sintesis pemanjangan rantai nukleotida. Enzim Polimerase Konsentrasi enzim yang digunakan sangat tergantung dari jenis enzim. Pada umumnya konsentrasi optimum berkisar antara 1,0-2,5 unit enzim setiap volume reaksi 50 µl. Konsentrasi dan kualitas primer Kualitas primer sangat tergantung pada kualitas oligoprimer dan OD (optical density).

Komponen yang diperlukan untuk reaksi PCR yaitu DNA cetakan. Merupakan keseluruhan DNA sampel yang di dalamnya terkandung fragmen DNA target. Primer , buffer dan DNA Polimerase, DNA polymerase merupakan enzim yang stabil dalam pemanasan dan umumnya digunakan enzim Taq DNA polimerase (Taq = Thermus aquaticus). Enzim ini tetap stabil mengamplifikasi DNA walaupun amplifikasi berjalan pada suhu mendekati titik didih air. Buffer / Dapar digunakan umumnya mengandung MgCl2 yang mempengaruhi stabilitas dan kerja enzim polimerase. dNTPS atau deoxynukleotide Triphosphates merupakan suatu nukleotida bebas yang berperan dalam perpanjangan primer melalui pembentukkan pasangan basa dengan nukleotida dari DNA target.

Hasil PCR yang baik jika DNA yang diPCR juga baik khususnya dari segi kualitas. Primer adalah suatu oligonukleotida yang memiliki 10 sampai 40 pb (pb = pasangan basa) dan merupakan komplementer dari DNA target. Pemilihan primer yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya reaksi polimerasi antara gen target dengan primer. Berikut adalah kriteria pemilihan primer panjang primer : 15-30 pb, kandungan GC sekitar 50%, temperatur penempelan kedua primer tidak jauh berbeda, dan urutan nukleotida yang sama harus dihindari.  Ciri Hasil Amplifikasi DNA yang baik yaitu di mana pita-pita DNA tidak semir atau jernih.

E.       Kesimpulan

1.      Kesimpulan

Praktikum amplifikasi DNA menggunakan PCR dapat disimpulkan bahwa :

a.       PC merupakan suatu motede yang digunakan untuk amplifikasi DNA

b.      Prinsip dasar dari amplifikasi DNA yaitu denaturasi, annaling, dan elongasi.

c.       Bahan yang digunakan dalam amplifikasi DNA yaitu DNA template, PCR, aquabidest dan primer mix.

2.      Saran

Sebaiknya dalam pelaksanaan praktikum tidak hanya satu jenis tanaman yang diekstraksi secara langsung, tapi ada bagian tanaman sehingga dapat dibandingkan secara langsung kualitas dan kuantitas DNA yang dihasilkan.

DAFTAR PUSTAKA

Astuti P, H Yasmin. 2011. Pedoman Praktikum Genetika Dasar. Jakarta Timur. PT. Pandu Aksara.

Choirul. 2006. Biologi Molekuler Sel. Jurusan Biologi Universitas. Bengkulu.

Fatchiyah 2014. Amplifikasi DNA. http://fatchiyah.lecture.ub.ac.id. Diakses pada tanggal 5 april 2014.

Novel SS, Safitri R, Nuswantara S. Analisis Distribusi Genotipe HPV Dengan Metode Linear Array HPV Genotyping Test. Bandung: Biologi FMIPA-UNPAD.

Scheffler, IE 2008. Mitochondrial DNA Sequencing and Anthropology. Mitochondria (ed. 2). Hoboken. NJ: John Wiley & Sons.

Yuwono T. Teori dan Aplikasi PCR. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.